Regulation of the Na+ -K+ -Cl-NKCC1 cotransporter by diffusion-capture and WNK signaling in neurons - Sorbonne Université Access content directly
Theses Year : 2021

Regulation of the Na+ -K+ -Cl-NKCC1 cotransporter by diffusion-capture and WNK signaling in neurons

Régulation du co-transporteur Na+ -K+ -Cl-NKCC1 par la signalisation WNK dans les neurones par diffusion-capture

Abstract

Neuronal inhibition is mainly mediated by GABAergic neurotransmission in the mature brain, while in early stages of development GABAA receptor activity is excitatory. Underlying these different responses, intracellular chloride levels are regulated by the activity of the co-transporters KCC2 and NKCC1. While KCC2-mediated chloride extrusion in mature brain has been described in many publications, NKCC1 role as a chloride loading transporter scarcely reported. However under several pathological conditions where synaptic inhibition is impaired, the role of NKCC1 has been highlighted. This is the case in epilepsy, whether from clinical epilepsy or experimental models, and is remarkable given the otherwise elusive functions of NKCC1 in the mature brain. As the regulatory pathways of NKCC1 are mainly unknown in the adult brain, we lack information on the underlying processes leading to its abrupt “awakening”. My PhD project aimed to determine whether and how NKCC1 is regulated by neuronal activity. I demonstrated using quantum-based single particle tracking, immunofluorescence and STORM imaging approaches that the membrane stability of NKCC1 is rapidly regulated by lateral diffusion in an activity-dependent manner at the surface of mature hippocampal cultured neurons. Basal glutamatergic activity regulates the membrane dynamics of NKCC1 in the axon but not in the somato-dendritic compartment indicating a specific regulatory mechanism depending on the cell compartment. In the somatodendritic compartment, NKCC1 is tuned by GABAAR-mediated signaling. Blocking or activating GABAA receptors with muscimol or gabazine rapidly slow down and confine transporters in the membrane. Transporter confinement would be consecutive to the recruitment and storage of transporters within endocytic zones. I then identified the underlying molecular mechanism. GABAergic activity would control the diffusion/capture and clustering of NKCC1 via the chloride-sensitive WNK1 kinase and the downstream SPAK and OSR1 kinases that would directly phosphorylate NKCC1 on key threonine T203/T207/T212/T217/T230 phosphorylation sites. The fact that KCC2 is also regulated in mature neurons by the WNK1/SPAK/OSR1 pathway and that this regulation has an inverse effect on the membrane stability, clustering and function of KCC2 indicates that this pathway could be a target of interest in pathologies associated with an alteration of chloride homeostasis. Inhibition of the pathway would prevent the loss of KCC2 and the increase of NKCC1 at the surface of the neuron, thus preventing the abnormal rise of [Cl-]i in the pathology and the resulting adverse effects. I thus assessed the relevance of inhibiting this kinase pathway in the context of ictogenesis. I used a PTZ-induced seizure assay in SPAK243A/243A mice, who express a non-active form of SPAK. Behavioral indicators (Racine scale) and electrocorticograms (EcoG) showed that the effects of the mutation on these variables were mild, with a reduced death rate and a non-significant decrease in the duration of seizures. The moderate effect could be due to the fact that other effector of the WNK1 pathway such as the OSR1 kinase remains active in these mice. This work provides the first in-depth characterization of NKCC1 regulation in neurons and emphasize targeting the WNK1/SPAK/OSR1 pathway to regulate neuronal chloride homeostasis and thus neuronal hyperactivity in epilepsy.
Dans le cerveau adulte, l’inhibition synaptique passe majoritairement par l’activité des récepteurs GABA de type A (RGABAA). Cette inhibition dépend du gradient électrochimique du chlorure, qui est principalement régulé par les co-transporteurs du chlore KCC2 et NKCC1. KCC2 transporte le chlore hors du neurone, tandis que NKCC1 est responsable de son influx. Ainsi au cours des premiers stades du développement l’activité de NKCC1 prédomine rendant l’activité des RGABAA excitatrice, cependant KCC2 voit son expression augmenter au cours du développement, résultant en une transmission GABAergique inhibitrice dans le cerveau adulte. Du fait de son importance fonctionnelle dans les neurones matures, les fonctions de KCC2, ainsi que sa régulation transcriptionnelle et post-traductionnelle sont nombreuses. En revanche peu de données existent sur les fonctions de NKCC1 dans le cerveau adulte, et sur sa régulation. Néanmoins dans des cas pathologiques en lien avec une altération de la transmission GABAergique, NKCC1 revêt une importance fonctionnelle certaine qui tranche avec son rôle apparemment discret dans l’homéostasie du chlore. Ceci est notamment le cas dans le contexte de l’épilepsie, expérimentale ou clinique. Résultant du peu de connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régulation de NKCC1 dans les neurones, la cause de ce “réveil” du co-transporteur est encore inconnue. J'ai démontré, à l'aide d'approches de suivi de particules uniques, d'immunofluorescence et d'imagerie STORM, que la stabilité membranaire de NKCC1 est rapidement régulée par diffusion latérale d’une manière dépendante de l'activité à la surface des neurones matures de l'hippocampe. L'activité glutamatergique basale régule la dynamique membranaire de NKCC1 dans l'axone mais pas dans le compartiment somato-dendritique, ce qui indique un mécanisme de régulation compartimentspécifique. Dans le compartiment somato-dendritique, NKCC1 est réglé par une signalisation médiée par le RGABAA. Le blocage ou l'activation des RGABAA par le muscimol ou la gabazine ralentit et confine les transporteurs dans la membrane. Le confinement des transporteurs serait consécutif à leur recrutement et stockage dans les zones endocytiques. J'ai ensuite identifié le mécanisme moléculaire sous-jacent. L'activité GABAergique contrôlerait la diffusion/capture et le regroupement de NKCC1 via la kinase WNK1 sensible aux chlorures et les kinases SPAK et OSR1 en aval qui phosphoryleraient directement NKCC1 sur les sites de phosphorylation clés de la thréonine T203/T207/T212/T217/T230. Le fait que KCC2 est également régulé dans les neurones matures par la voie WNK1/SPAK/OSR1 et que cette régulation a un effet inverse sur la stabilité membranaire, l’agrégation et la fonction de KCC2 indique que cette voie pourrait être une cible d'intérêt dans les pathologies associées à une altération de l'homéostasie du chlorure. L'inhibition de cette voie permettrait d'éviter la perte de KCC2 et l'augmentation de NKCC1 à la surface du neurone, empêchant ainsi l'augmentation anormale de [Cl-]i dans la pathologie et les effets néfastes qui en résultent. J'ai donc évalué la pertinence de l'inhibition de cette voie dans le contexte de l'ictogenèse. J'ai utilisé un test d’ictogénese induite par PTZ dans des souris SPAK243A/243A, qui expriment une forme non active de SPAK. Les indicateurs comportementaux (échelle de Racine) et les électrocorticogrammes ont montré que les effets de la mutation sur ces variables étaient légers, avec un taux de mortalité réduit et une diminution non significative de la durée des crises. Cet effet modéré pourrait être dû au fait qu'un autre effecteur de la voie WNK1, comme la kinase OSR1, reste actif chez ces souris. Ce travail fournit la première caractérisation approfondie de la régulation de NKCC1 dans les neurones et met l'accent sur le ciblage de la voie WNK1/SPAK/OSR1 pour réguler l'homéostasie du chlorure neuronal et donc l'hyperactivité neuronale dans l'épilepsie.
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Etienne Côme. Regulation of the Na+ -K+ -Cl-NKCC1 cotransporter by diffusion-capture and WNK signaling in neurons. Neurobiology. Sorbone Université, 2021. English. ⟨NNT : 2021SORUS054⟩. ⟨tel-03974325⟩
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