Atypical myotonic dystrophy type 1 families and how interruption(s) impact CTG repeat instability
Familles atypiques et rôle des interruptions sur l'instabilité des triplets CTG impliqués dans la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1)
Résumé
The instability of microsatellite repeats is a key factor for 40 human diseases. Among these diseases, Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) is an autonomic dominant neuromuscular disease characterized by a strong phenomenon of anticipation: the symptoms worsen and appear earlier from one generation to the next. DM1 is caused by expanded CTG repeats in the 3 'UTR of the DMPK gene. In the general population, the CTG repeat is stable and ranges from 5 to 37 repetitions. Patients with DM1 have repeats that range from 50 to> 1000 CTG and are unstable from one generation to the next (intergenerational instability) and in the tissues (somatic instability), with a bias towards expansions. In general, there is a good correlation between the length of abnormal repeats and the symptoms severity. Instability of the CTG repeats involves various factors (DNA repair, transcription, replication, secondary structures etc...). However, the CTG repeats contraction mechanisms remain poorly understood. Repeat interruptions have been reported in patients with reduced CTG instability. It is suggested that interruptions could be a stabilization or contraction factor but so far, no direct demonstration of their impact has been presented. The aim of my thesis is to demonstrate whether and how interruptions impact the instability of CTG repeat expansions. We studied atypical DM1 families, with no anticipation and associated with contractions of the repeats on 2 to 4 successive transmissions. All patients in these families showed interruptions: a single CAG at 5 'of the CTG repeats (family A), or several CCG interruptions at 5' or 3 'of the repeat (in families B and E respectively). We demonstrated that the amplitude of somatic instability was reduced at least for families A and B. These interruptions are good candidates to learn more about the contraction / stabilization mechanisms of CTG repeats. I first demonstrated in vitro that the secondary structures were different between pure or interrupted CTG repeats. Then, I compared the binding of nuclear proteins to CTG repeats with or without interruption by EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). My results demonstrated different binding profiles depending on the nature of the repeats. To further study the impact of interruptions on CTG instability, I derived HEK293 cell models using Phi-Integrase technology and plasmids expressing the CTG repeats . These cells allow bidirectional transcription of the 3' UTR region of mutant DMPK carrying pure or interrupted CTG repeats, as observed in the family A. In these cells, I demonstrated via the newly optimized Flash-Small-Pool-PCR that the somatic mosaic of the interrupted CTG repeats was reduced compared to the pure repeat. I have also detected that the formation of DNA / RNA hybrids (R-loop) is reduced in cells with the single CAG interruption and follows the transcriptional pattern of mutant DMPK antisense transcripts. Thus, our cellular model demonstrates that the interruption of CAG has an impact on the instability of the CTG repeats, implying at least the metabolism of the R-loops. A better understanding of the mechanisms of contraction or stabilization of abnormal CTG repeats is crucial to being able to cure the molecular defect responsible for DM1. My project provides new insights into the mechanisms of instability of CTG repeats, which can provide new therapeutic targets and new clues to improve the prognosis of DM1.
L'instabilité des répétitions de microsatellites est un facteur clé pour plus de 40 maladies humaines. Parmi elles, la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire autosomique dominante caractérisée par un fort phénomène d'anticipation : les symptômes s'aggravent et apparaissent plus tôt d'une génération à l'autre. La DM1 est causée par une expansion de triplet CTG répétés dans la région 3'UTR du gène DMPK. Dans la population générale, la répétition CTG est stable et varie de 5 à 37 répétitions. Les patients DM1 ont des répétitions instables variant de 50 à > 1 000 CTG d'une génération à l'autre (instabilité intergénérationnelle) et dans les tissus (instabilité somatique), avec un biais vers les expansions. En général, il existe une bonne corrélation entre la longueur des répétitions anormales et la gravité des symptômes. L'instabilité des triplets CTG implique divers facteurs (réparation, transcription, structures secondaires...). Cependant, les mécanismes de contractions des triplets CTG restent peu compris. Des interruptions dans les répétitions ont été rapportées chez des patients avec une instabilité des triplets CTG réduite. Il est suggéré que les interruptions puissent être un facteur de stabilisation ou de contraction mais jusqu'à présent, aucune démonstration directe de leur impact n'a été présentée. L'objectif de ma thèse est de démontrer si les interruptions impactent l'instabilité des triplets CTG et par quels mécanismes. Nous avons étudié des familles DM1 atypiques, exemptes de phénomène d'anticipation et présentant des contractions de triplets CTG sur 2 à 4 transmissions successives. Tous les patients de ces familles présentent des interruptions : un seul CAG en 5' de la répétition CTG (famille A), ou plusieurs interruptions de la CCG en 5' ou 3' de la répétition (dans les familles B et E respectivement). Nous avons démontré que l'amplitude de l'instabilité somatique est réduite au moins pour les familles A et B. Ces d'interruptions sont de bons candidats pour étudier les mécanismes de contraction/ stabilisation des répétitions CTG. J'ai d'abord démontré in vitro que les structures secondaires de l'ADN étaient différentes entre les répétitions pures ou interrompues. J'ai ensuite comparé la fixation des protéines nucléaires aux répétitions CTG, avec ou sans interruption, par EMSA. Mes résultats ont démontré des profils de fixation différents selon la nature des répétitions. Afin d'étudier plus précisément l'impact des interruptions sur l'instabilité des répétitions, j'ai dérivé des modèles de cellules HEK293 en utilisant la technologie Phi-Integrase permettant l'intégration de plasmides d'expression. Ces cellules permettent la transcription bidirectionnelle de la région 3 'UTR du gène DMPK mutant portant des répétitions CTG pures ou interrompues avec une unique interruption CAG en 5' des répétitions CTG, reproduisant le motif identifié chez la famille A. Grâce à ce modèle, j'ai démontré que la mosaïque somatique des répétitions CTG interrompues était réduite comparée à celle présentée par les clones à répétitions pures reproduisant ainsi ce qui a été précédemment observée chez la famille A comparée à des contrôles DM1 à répétitions pures. Avec ce modèle, j'ai montré que la formation d'hybrides ADN/ARN (R-loops) est réduite dans les cellules avec une seule interruption CAG et qu'il y a une bonne corrélation entre la formation d'R-loop et le niveau de transcription de DMPK mutant antisens. Ainsi, ce modèle cellulaire démontre que l'interruption de CAG a un impact sur l'instabilité des répétitions CTG, impliquant notamment le métabolisme des R-loops. Une meilleure compréhension des mécanismes de contraction ou de stabilisation des répétitions anormales de CTG est crucial pour pouvoir guérir la DM1. Mon projet fournit de nouvelles informations sur les mécanismes de l'instabilité des triplets CTG, qui peuvent orienter vers de nouvelles cibles thérapeutiques.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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